Kit de prueba rápida del virus de la peste porcina africana

Kit de prueba rápida del virus de la peste porcina africana Instrucciones

(Kit de Amplificación Rápida de Ácidos Nucleicos)

[Nombre del Producto]

Nombre Genérico: Kit de prueba rápida del virus de la peste porcina africana (Sonda de Fluorescencia por PCR)

[Uso Previsto]

Este kit se utiliza principalmente para detectar el ácido nucleico del virus de la peste porcina africana (VPPA) en sangre anticoagulada y muestras clínicas de cerdos presuntamente infectados Es adecuado para la detección del VPPA, el diagnóstico auxiliar y las investigaciones epidemiológicas

[Componentes del Kit]

1 Componentes del Kit y Condiciones de Almacenamiento

2 Materiales necesarios: Solución salina normal, puntas de pipeta estériles, tubos de reacción de PCR fluorescentes, rotulador, etc

[Procedimiento] I Preparación de la muestra

1 Muestra de sangre: Recoja muestras de sangre anticoagulada (con EDTA como anticoagulante) o suero y numere para su uso posterior

2 Muestra de tejido: Recoja muestras de tejido enfermo, como bazo, hígado, ganglios linfáticos y amígdalas, o 0,1 g (del tamaño de una semilla de soja) de una garrapata blanda Corte la muestra en trozos pequeños con tijeras oftálmicas y homogeneícela bien o tritúrela en un homogeneizador de tejidos o mortero Añada 1 ml de solución salina normal y mezcle bien Centrifugue a 8000 rpm durante 2 minutos a 4 °C Recoja el sobrenadante en tubos de centrífuga estériles y numere para su uso posterior

II Extracción de ADN

Coloque 20 μL de la Solución de Reacción A en un tubo de centrífuga nuevo de 1,5 ml Añadir 2 μL de anticoagulante, suero o sobrenadante tisular y mezclar bien Dejar reposar a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) durante 3 minutos Añadir 20 μL de la Solución de Reacción B y mezclar bien pipeteando Si se utiliza sangre completa anticoagulada, centrifugar a 8000 rpm durante 2 minutos más para preparar la solución de ADN

2 Amplificación por PCR

1 Preparación: Retirar la mezcla de reacción de PCR y la mezcla enzimática Descongelarlas completamente a temperatura ambiente, mezclar bien y centrifugar brevemente Se puede retirar toda la mezcla enzimática y añadirla directamente a la mezcla de reacción de PCR Mezclar bien, centrifugar brevemente y dividir en alícuotas de 20 μL para su uso Como alternativa, tomar un volumen de prueba de 17 μL de mezcla de reacción de PCR y 3 μL de mezcla enzimática por alícuota, mezclar ambos, centrifugar brevemente y dividir en alícuotas de 20 μL en tubos de reacción de PCR fluorescentes específicos Congele inmediatamente los reactivos restantes (Protéjalos de la luz durante esta operación)

2 Adición de la muestra y amplificación: Añada 5 μL de ADN de muestra o control negativo o positivo a cada uno de los tubos de reacción de PCR mencionados, mezcle bien y centrifugue brevemente Coloque el tubo en un instrumento de PCR fluorescente y ejecute el siguiente programa:

Paso Condiciones Número de ciclos Tratamiento UNG 50 °C: 2 minutos 1 Predesnaturalización 95 °C: 3 minutos 1 Preamplificación 95 °C: 8 segundos 5 Amplificación PCR 95 °C: 8 segundos, 55 °C: 8 segundos, 40 segundos

Seleccione FAM como canal de fluorescencia y recopile las señales de fluorescencia a 55 °C durante cada uno de los 40 ciclos Ajuste el volumen de amplificación a 25 μL y seleccione los modos de referencia pasiva y de extinción

(Nota: Si un instrumento de PCR de fluorescencia (como el ABI7500) no funciona debido a un tiempo de espera corto tras seguir el protocolo del manual, las condiciones de preamplificación y PCR pueden modificarse a 95 °C: 5 segundos o 55 °C: 30 segundos)

[Evaluación de resultados] 1 Ajuste de la línea base y del umbral: El ajuste de la línea base se realiza utilizando las señales de fluorescencia de 6 a 15 ciclos El umbral debe establecerse de forma que la línea del umbral supere ligeramente el punto más alto de la curva de fluorescencia del control negativo

2 Control de calidad: Una vez finalizada la reacción, el control negativo no debe mostrar una curva de amplificación definida, con un valor Ct >38 o ninguno El control positivo debe tener un valor Ct ≤30,0 y una curva de amplificación clara De lo contrario, el experimento se considerará inválido

3 Evaluación de la muestra: Si la muestra muestra un aumento exponencial de la señal de fluorescencia y un valor Ct <35,0, se considera positiva Si no se detecta ningún valor de Ct, si este es > 38 o si no hay una curva de amplificación clara, la muestra se considera negativa Si el valor de Ct es 35 ≤ Ct ≤ 8, se vuelve a analizar la muestra Si el resultado repetido es positivo, se considera positivo; de lo contrario, se considera negativo

[Notas] 1 Lea atentamente las instrucciones de este kit antes de realizar el experimento y siga estrictamente los procedimientos operativos Un control preciso del tiempo, el volumen de reactivo y otros parámetros durante el funcionamiento proporcionará los mejores resultados

2 El laboratorio debe gestionarse en estricta conformidad con la normativa vigente Cada área debe tener requisitos específicos para el personal, el equipo, los reactivos y el flujo de aire

3 Asegúrese de que todos los consumibles estén limpios y estériles Tras la extracción del ácido nucleico, proceda al siguiente paso del experimento o congélelo lo antes posible

4 Los reactivos premezclados deben utilizarse lo antes posible Si se utilizan en exteriores, deben almacenarse en una caja de espuma con compresas frías Después de cada día de análisis, deben congelarse rápidamente

5 Evite tocar los tubos de PCR fluorescentes con las manos descubiertas o con guantes usados Use guantes de látex desechables sin material fluorescente durante el análisis

6 Antes de su uso, los reactivos congelados deben descongelarse completamente a temperatura ambiente, mezclarse bien y centrifugarse brevemente para permitir que el líquido se asiente completamente en el fondo del tubo

7 Después de tapar la muestra y el control negativo, agregue el control positivo en un ambiente ventilado y tápelo rápidamente para evitar la contaminación por falsos positivos por componentes cruzados y aerosoles

8 Después de la reacción de amplificación, los tubos de PCR no deben abrirse Deben recogerse rápidamente con otros residuos experimentales y desecharse de forma segura fuera del laboratorio de PCR

[Especificación] 50 tubos/caja

[Fecha de almacenamiento y caducidad] Conservar por debajo de -20 °C, protegido de la luz Fecha de caducidad: 12 meses

Solo para uso diagnóstico veterinario